制备酵母感受态细胞并进行质(zhi)粒转化

（）    抽提BD和(he)AD的相关质粒(li)（浓度最(zui)好(hao)在μL）；

（）    事(shi)先(xian)制备(bei)所(suo)需(xu)的培养(yang)基和平板；

（）   酵母(mu)感(gan)受(shou)态的(de)制备：

）           将酵(jiao)母菌(jun)株(zhu)或(huo)者是(shi)其他的菌株)在YPDA培(pei)养基平(ping)板(ban)上划(hua)线(xian)，30℃倒(dao)置培养3天(tian)左右，直到克隆(long)大(da)小为(wei)；

）           挑取(qu)一(yi)个酵母克(ke)隆于7.5ml的YPDA液体培养基中（50ml灭(mie)菌的离(li)心管），并且振荡转速(su)200rpm)培养24h左右；

）           将这7.5ml将菌液(ye)注(zhu)入大容器(qi)中（具体容(rong)量(liang)由转换(huan)个(ge)数(shu)决定(ding)））YPDA液体培养基中6h左右(you)，30℃  200rpm 振(zhen)荡培养；

）           室(shi)温4000rpm离心(xin)5min收(shou)集菌体(ti)，排(pai)除上(shang)清(qing)并采(cai)用(yong)40ml无(wu)菌去(qu)离子水(shui)重悬(xuan)酵母；

）           室温(wen)4000rpm离心5min收集(ji)菌体，排除(chu)上清并采用3ml 1.1×TE/LiAc溶液重悬酵母；

）           将重悬液分装(zhuang)为2个1.5ml的离心管，4000rpm离心；

）           把(ba)上清倒掉(diao)，然后把酵母重(zhong)新(xin)悬浮(fu)于其(qi)中600ul1.1×TE/LiAc溶液；

）           在一个1.5ml将(jiang)以(yi)下成(cheng)分加入(ru)干(gan)净的离心管(guan)中(zhong)，并进(jin)行灭菌处(chu)理(li)；

10ul herring testes carrier DNA (使用前(qian)在(zai)°C水浴(yu)锅(guo)中变形(xing)10分钟,立即放在冰(bing)上,以后(hou)使(shi)用，就(jiu)不(bu)需要(yao)变(bian)性),具体设(she)置的实验(yan)如(ru)下:

	实验组(zu)	阴(yin)性(xing)对照1	阴性对照(zhao)2	用量
1	BK-bait	pGBKT7	BK-bait	0.2ug
2	AD-prey	AD-prey	pGADT7	0.1ug

 9) 将100ul 感受态细胞(bao)加入到DNA中；

10)加(jia)入600ul PEG/LiAc solution 快(kuai)速彻(che)底(di)的混(hun)匀(yun)；

11) 放(fang)置(zhi)于30℃并(bing)且振荡转(zhuan)速200rpm)培养30分钟(zhong)；

12) 每(mei)管加入70μl DMSO，轻(qing)轻上下颠(dian)倒混匀,42℃水浴热(re)激15分(fen)钟；

13) 冰浴2分钟, 4000rpm，2将菌体离心收集，上清液倾倒；

14)用500ul TE（PH 8.00）重悬菌体，离心4000rpm，2分钟离心收集菌体，舍(she)弃(qi)上清液，最后使用50ul TE重悬菌体涂(tu)布(bu)于相应(ying)的SD-Trp/-Leu固(gu)体平板上，30℃ 倒置培养 3大约(yue)需要天的时(shi)间，直到(dao)长出(chu)所需大小(xiao)的克隆；

15）平板上选(xuan)择(ze)合适(shi)尺(chi)寸(cun)的克隆进行挑(tiao)选，并在其上操(cao)作700ul的SD-Trp/-Leu液体培养基(ji)中30震荡(dang)过夜(ye)培养，然(ran)后按1:10,1:100,1:1000的稀(xi)释(shi)比(bi)转移(yi)到及(ji)SD-Trp/-Leu/-His/-Ade固体培养基上培养，大约2大约一天左(zuo)右，就能(neng)观(guan)察(cha)到菌落(luo)的生长(zhang)情(qing)况(kuang)

16）对(dui)于在或者是SD-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上有良好的生长，而(er)阴性对照没(mei)有(you)生(sheng)长的平板可被(bei)保(bao)存(cun)拍(pai)照记(ji)录(lu)（若有由(you)于His渗(shen)漏(lou)表(biao)达(da)造(zao)成的背(bei)景(jing)杂(za)菌，可在培养基中加入1mM  3-AT进行(xing)抑(yi)制）。

酵母相(xiang)关试(shi)剂的配(pei)制：

1    YPD培养基（1L）

PEPTONE                 20g

Yeast extract               10g

加ddH2O 溶解后，定容至1L,并用KOH调PH至(zhi)5.80，（若(ruo)为固体加入Agar  20g）高(gao)压(ya)灭菌，如果需要放置平板，则(ze)在稍(shao)冷(leng)却(que)后加入40％的葡(pu)萄(tao)糖溶(rong)液（终浓度(du)2％）。

1 2.     YPDA培养基（1L）

1L YPD液体培养基中加入15ml 0.2％Adenine hemisulfate 溶液（终(zhong)浓(nong)度为0.03％）

1 3.     SD-Trp/-Leu和SD-Trp/-Leu/-His培养基的配置（1L）

Minimal SD base（Clontech）    26.7g

SD--Trp/-Leu    0.64g，及SD-Trp/-Leu/-His/-Ade   0.60g

加水溶解并定容至1L,并且(qie)调到5.80，若为固体培养基则加入20g Agar（终浓度2％），并高压灭菌（灭菌15min）

1 4.      1.1 ×TE/LiAc

现(xian)配现用：1.1ml  10×TE和1.1ml 1M  LiAc ,用无菌去离子(zi)水补充(chong)至10ml。

1 5.      PEG/ LiAc

现配现用：1ml  10×TE和1ml 1M  LiAc ,然后用50％ PEG3350 溶液补至10ml

 

注意(yi)问(wen)题：

1 做(zuo)酵母时，1.1 ×，PEG/ LiAc混合(he)溶液必须(xu)即(ji)兴(xing)配制(zhi)和使用；

2 当(dang)目(mu)的蛋(dan)白在如果酵母感受态(tai)的浓度较(jiao)低(di)，可(ke)以考(kao)虑(lv)提(ti)高其量；

3 在加入切(qie)勿(wu)剧(ju)烈(lie)震(zhen)动(dong)，以免(mian)影(ying)响(xiang)感受态的效(xiao)率(lv)；

4 所有步骤(zhou)均(jun)在无菌台上进行，以防(fang)止(zhi)其他(ta)杂菌污(wu)染(ran)；

5 ，SD-Trp/-Leu/-His 及SD-Trp/-Leu/-His/-Ade 加水溶解(jie)并定容至1L,并且调(diao)pH到5.80，务(wu)必(bi)要调节(jie)pH，否则，如果涂抹(mo)培养基时遇(yu)到很松(song)软(ruan)的情况，会(hui)导(dao)致(zhi)培养基破(po)裂(lie)成碎(sui)渣，从(cong)而延(yan)误(wu)实(shi)验进程(cheng)；

解决(jue)自(zi)激(ji)活(huo)问题(ti)的方(fang)法(fa)如下所述(shu)：

加入一定浓度的3AT（如1mM）；

如果目的蛋白(bai)在AD上有自激活，就换到BD那(na)一边(bian)；

） 可以放在25°C培养；

）如果无法解决问题，考虑减少(shao)目标(biao)蛋白的长度。